细胞是生物学实验的重要材料，也是生物细胞学实验的基础。药物、基因功能、疾病机理等的相关研究多数需要在细胞水平进行阐释。在细胞培养和消化的操作过程中，受人员操作和环境条件的影响比较大，因此每个环节都有可能导致操作的失败。以下是我们汇总了关于细胞培养和细胞消化的小贴士，希望能给正操作细胞培养和细胞消化的研发人员带来帮助。
细胞系身份需明确
之所以选定某种细胞系开展实验，是因为所选细胞系的一些特性符合研究方向的设定。比如组织特性，疾病特性，功能特性，基因表达特性等。一旦用错了细胞株，对研究结果的判断就会带来很大的误差和不确定性。
而近年来，多个权威机构发现细胞系在培养和流通过程中，出现了很严重的交叉污染。据不完全统计，单就HeLa细胞系导致的污染致使3万多篇论文结果的准确性存在问题（doi:10.1371/journal.pone.0186281）。而这种情况不仅仅限于HeLa细胞。多个权威机构研究人员检测发现超过451个细胞系已被其它细胞完全吸收，在所检测细胞中污染占比46%，可见细胞交叉污染的现象非常普遍。因此，做实验前对细胞株验明正身非常重要。如果是在机构购买的细胞株，最好能让供方提供合格的STR鉴定报告。
细胞培养和消化
细胞培养大致分为两种，一种是悬浮细胞培养，一种是贴壁细胞培养，无论是哪种方式，进行细胞培养时一般会通过以下几个步骤：
当然以上只是细胞培养过程的一个基本框架，实际操作可能会因细胞类型、实验要求和实验室的标准操作规程而有所不同。
细胞消化是研发人员在操作细胞培养过程中一个步骤，一般细胞长至80%-90%密度则需要传代消化，贴壁细胞传代前，需要把细胞用消化试剂从培养容器表面解离出来，细胞得以分离成单个悬液传代至含新鲜培养基的新容器内；常见的细胞消化方法有三种：酶消化法、离子螯合法、机械消化法。其中，酶消化法是用得最多的，主要使用胰蛋白酶，一般浓度在0.25-0.5%，消化的时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化。一般来说，0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37℃条件下消化1-5分钟就足够了。需要注意的是，Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，因此不含Ca2+、Mg2+，含EDTA的胰酶活性更高; 最后，可用含血清的培养基终止胰酶消化。
胰蛋白酶大致可以分为两种，一种是传统使用的动物源性的胰蛋白酶，主要提取自牛或猪的胰腺组织，其缺点是会带来病毒污染的风险；另一种则是非动物源性胰酶，即利用基因重组技术生产的重组胰蛋白酶。重组胰蛋白酶具有许多潜在用途，包括用于生产药品、用作研究工具以及生物技术应用，例如蛋白类药物的生产、细胞的分离、疫苗生产以及用于细胞分析的组织样本的制备，同时解决了传统使用的猪或牛胰蛋白酶可能带来病毒污染的风险。我国2020版药典第一次收录了无动物源性重组胰蛋白酶的质量标准。总体而言，重组胰蛋白酶在生物药及科研领域是不可缺少的工具酶。
重组胰蛋白酶在实际应用中的使用步骤：
① 配制缓冲液：用灭菌水配制10L HBSS平衡盐溶液。
HBSS平衡盐溶液配方：400mg/L KCl，60mg/L KH2PO4，350mg/L NaHCO3，8000mg/L NaCl，121mg/L Na2HPO4·12H2O，1000mg/L葡萄糖。
② 取1g重组胰蛋白酶（细胞培养级），用HBSS平衡盐溶液溶解澄清，使胰蛋白酶的酶活浓度为500USP units/ml-1500 USP units/ml，或者使胰蛋白酶的质量浓度为0.1mg/ml-0.3mg/ml。（500USP units/ml的浓度适合大部分细胞的消化，原代细胞、组织等可适当提高浓度至1500 USP units/ml）
注意事项
1）冀百康生物重组胰蛋白酶消化液含有EDTA，应注意其不同细胞的使用适配性。且本重组胰蛋白酶消化液不含抑菌剂，使用过程中要特别注意无菌操作，避免消化液被微生物污染。
2）建议将本重组胰蛋白酶消化液分装为100ml/瓶，在-15~-20℃条件下存放，能稳定存放12 个月。不宜 4℃长期保存，切忌反复冻融造成胰蛋白酶的活性降低，并可减少污染的机会。
常见问题
Q1：什么是EDTA？为什么重组胰蛋白酶要加入EDTA？
EDTA作用较胰蛋白酶缓和，主要作用在于能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2，这些离子是维持组织完整的重要因素。但EDTA单独使用不能使细胞完全分散，因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果较好。常用比例为1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液浓度为0.02%，用不含Ca2+、Mg2的BSS配置。如果使用EDTA，在终止消化前，需用缓冲液将消化液清除后才能加培养液。
Q2：如何控制胰酶消化时间？
不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度，是否含EDTA，胰酶的储存时间，胰酶的储存温度，是否反复冻融，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞，建议先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。
Q3: 培养基误存于-20℃，溶解后继续使用?
在-20℃下，培养基中的盐容易析出，培养基再次融化后，有的盐可能无法重新溶解，从而导致培养基营养成分和渗透压改变，培养细胞时，容易细胞破裂而死亡，建议丢弃该培养基,使用新的培养基用于细胞培养。
Q4：消化过度的主要特征有哪些?
会导致相当一部分细胞损伤和死亡，刚传代后的培养液表面漂浮细胞团，肉眼可见漂着小片白色膜状物。如果细胞团中都是死细胞，则不会贴壁。如果细胞团中仍存在有活力的细胞，就会贴壁造成局部细胞密度不均匀，该局部较快形成中央坏死细胞区 。
Q5：细胞消化不下来是什么情况?
(1) 有些细胞贴壁比较牢，因此每次消化吹打之后总会剩下一些细胞，或者细胞长得较好而培养瓶太久没换，为了顾全大部分有活力的细胞，细胞消化要适可而止。
(2) 不同种类的细胞所需消化时间也不同。因为贴壁细胞的消化一般在2分钟左右，对于个别出现的细胞难以消化，经过多次消化和反复吹打之后仍无效，就放弃吧。
*参考文献1.Drexler HG, Uphoff CC. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 2002;39:75–90.2.Merten O. Virus contaminations of cell cultures – A biotechnological view. Cytotechnology. 2002;39:91–116.3.生物医学小坑https://picx.zhimg.com/80/v2-7229d60c7ce1e7c56a532394fp?source=1940ef5c.
